中文名称：辣根过氧化物酶

英文名称：Peroxidase

别名：过氧化物酶

CAS：9003-99-0

EC：1.11.1.7

来源：鲜辣根

性状：红棕色无定形冻干粉末

活性：≥500 U/mg RZ≥3.0

杂质：磷酸酶≤0.001%

稳定性：−20℃可保存3年

分子量：～40 KDa

等电点：3.0～9.0

抑制剂：氰化物、硫化物、氟化物、叠氮化物

最佳pH：6.0−7.0

最佳温度：45℃

应用：该酶用于临床分析中对过氧化氢的酶学测定、组织和细胞化学中的蛋白质示踪剂，神经学中的实验工具以及酶免疫分析中的酶标记。 概要：辣根过氧化物酶是从辣根（Amoracia rusticana）中分离出来的，属于过氧化物酶的铁原卟啉基团。与过氧化氢结合，产生的络合物可以氧化各种各样的供氢体。HRP 是含有四个二硫键的单链多肽，它是一种含有 18%碳水化合物的糖蛋白。碳水化合物由半乳糖、拉伯糖、木糖、岩藻糖、甘露糖、甘露糖胺和半乳糖胺组成，具体取决于特定同工酶。HRP同工酶至少存在 7 种。

酶活检测  

一、方法：该方法用于使用连苯三酚作为底物测定过氧化物酶的酶活性。

单位定义：一个单位的过氧化物酶在pH 6.0、20 ℃下，在20秒钟内从连苯三酚形成1.0毫克红陪酚。该单位等同于在25 °C每分钟~18 µM单位。

二、所需试剂和设备 1.0 M磷酸二氢钾溶液、1.0 M磷酸氢二钾溶液、过氧化氢，30% (w/w) 溶液、连苯三酚、比色皿和恒温分光光度计

１、试剂配制 使用超纯水（25 °C时 ≥ 18 MΩ×cm电阻率）制备试剂。

１.１磷酸盐缓冲液（100 mM磷酸钾缓冲液，pH 6.0，20°C）— 加入17.36 mL的1.0 M磷酸二氢钾溶液（P8709）。加入2.64 mL的1.0 M磷酸氢二钾溶液并用超纯水定容至200 mL。用1 N KOH或1 N HCl在20℃下调节至pH 6.0。将磷酸盐缓冲液储存在冰上。 １.２过氧化物溶液（0.50％ [w/w] 过氧化氢[H2O2] 溶液）— 使用过氧化氢，30% (w/w) 溶液（H1009）在超纯水中制备1:60稀释液。

注意：制备新鲜稀释液用于对照和样品，并将溶液储存在加盖的4打兰小管中，置于冰上，避免暴露于空气。

１.３连苯三酚溶液（5％ [w/v] 连苯三酚溶液）— 用连苯三酚（254002）和超纯水在琥珀色（或用铝箔包裹的）小管中制备50 mg/mL溶液。

注意：现配现用，并将此溶液避光保存在冰上。

１.４过氧化物酶溶液 — 在冷的磷酸盐缓冲液中制备10 mg/mL过氧化物酶溶液。在冷的磷酸盐缓冲液中制备含有0.45-0.75单位/mL过氧化物酶的工作溶液，现配现用。

注意：10 mg/mL原液可用于RZ因子测定。

三、操作流程 最终测定浓度 — 在3.00 mL反应混合物中，最终浓度为14 mM磷酸钾，0.027％（v/v）过氧化氢，0.5％（w/v）连苯三酚，和0.45-0.75单位过氧化物酶。

注意：一次只运行一个比色皿，因为最大速率出现在第一分钟。

1.移取以下试剂到合适的比色皿中：

2.倒置混合，并在适当恒温的分光光度计中平衡至20 ℃约10分钟。

注意：所有比色皿可同时孵育，但一次只读取一个比色皿。

3.然后添加： 试剂 空白样(ml) 检测1（mL） 检测2（mL） 检测3（mL） 磷酸盐缓冲液 0.1 – – – 过氧化物酶工作溶液 – 0.1 0.1 0.1

4.立即通过倒置混合，并记录3分钟内的A420增量。对于所有测试和空白样，使用最大线性速率或0.5分钟间隔获取△A420/20秒。 适用性标准：△A420/20秒比率应在0.18-0.34之间。必要时可对酶浓度进行修改。

四、结果

计算公式   

Units/ml=（△A420/20 sec样品 - △A420/20 sec空白）×3×df/（12×0.1）

式中：

3 = 测定的体积（以毫升计）

df = 稀释因子

12.0 = 1 mg/ml红陪酚在420 nm处的消光系数（内部测定）

0.1 = 使用的酶体积（以毫升计）